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薛文博士Nature子刊,专访胡文辉教授

时间:2019-08-28 10:27来源:科学研究
日本团队研究结果: 乙肝病毒基因组嵌入人类基因与癌变相关 薛文博士Nature子刊:高效、安全地利用CRISPR治疗疾病CRISPR基因组编辑技术使得科学家们能够剪掉一段特异的DNA序列,用新

日本团队研究结果: 乙肝病毒基因组嵌入人类基因与癌变相关

薛文博士Nature子刊:高效、安全地利用CRISPR治疗疾病 CRISPR基因组编辑技术使得科学家们能够剪掉一段特异的DNA序列,用新序列来替代它,其有潜力治愈缺陷基因引起的一些疾病。为了实现这种潜能,科学家们必须找到一种方法安全地将CRISPR机器和校正的DNA拷贝传送到病变细胞中去。

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科技日报东京5月28日电 日本理化学研究所和广岛大学近日宣布,他们的联合研究小组对肝脏感染乙型肝炎病毒进行基因组分析,发现了乙肝病毒嵌入人类基因组的机制和病毒致癌的部分机制。

现在麻省理工学院的研究人员开发出了一种方法,能够比以往更有效地传送CRISPR基因组修复元件,他们相信这种方法也能够更安全地供人类使用。在小鼠研究中,他们发现能够在6%的肝细胞中修正引起酪氨酸血症的突变基因——这样的效率足以治愈罹患这种罕见肝病的小鼠。突破性的成果发布在2月1日的《自然生物技术》杂志上。

人类与艾滋病已经斗争了超30年,从最初的绝症到现在的有效治疗,艾滋病正朝着慢性疾病的方向慢慢转变。但是,科学家们一直未曾放弃“治愈艾滋病”的梦想,他们正在努力研发能够治愈或者预防艾滋病的“良方”。

全世界约3.5亿人感染乙肝病毒,每年约88万人因乙肝病毒死亡。乙肝病毒感染治疗手段有限,主要使用干扰素和核酸模拟制剂,不但需要长期服药,还存在副作用和病毒耐药性等问题;而且治疗效果并不理想,多数患者仍然会从乙肝病毒感染转向慢性肝炎和肝癌。

麻省大学医学院分子医学助理教授薛文,及MIT化学工程系副教授、Koch综合癌症研究所及医学工程学与科学研究所成员DanielAnderson是这篇论文的共同资深作者。薛文博士早年毕业于南京大学,在麻省理工学院攻读博士后。其实验室的主要研究兴趣是利用小RNA工具,例如RNAi介导的沉默及CRISPR/Cas9介导的基因组编辑来开发出肝癌和肺癌遗传模型。

3月30日,Cell子刊《Molecular Therapy》在线发表了一篇题为“In Vivo Excision of HIV-1 Provirus by saCas9 and Multiplex Single-Guide RNAs in Animal Models”的文章,揭示了科学家们首次利用“魔剪”技术CRISPR有效剔除人源化小鼠多个器官中潜伏的人类艾滋病病毒。

一般认为感染乙肝病毒后,在人类肝细胞基因中发生乙肝病毒基因组嵌入,发展为肝癌。此次研究小组对乙肝病毒感染者的肝癌和邻近肝组织及乙肝病毒感染小鼠模型中提取的DNA进行了检测,并详细分析了1600多处嵌入位点。结果发现,在感染3周至7周的小鼠模型中,乙肝病毒基因主要集中在线粒体基因中;在人类肝癌和邻近肝组织中每个样品被编入1279个位点,基因组嵌入部位多位于染色质开放的区域。在肝癌中,被编入特定的癌症相关基因,这被认为有助于发生癌变。此外,研究小组还证实了乙肝病毒与人类融合基因的表达,并推测这与乙肝病毒感染和癌变有关。

2014年,薛文博士曾作为主要作者在Nature杂志上发表论文,他与麻省理工学院的同事们一起,采用CRISPR基因编辑系统将致癌突变导入到了成年小鼠肝脏中,由此构建出了小鼠癌症模型(延伸阅读:Nature重要成果:用CRISPR构建癌症模型)。

“利用基因编辑治疗艾滋病”的研究思路从何而来?该技术如何应对HIV变异问题?它对于艾滋病治疗将会产生怎样的意义?新豪天地登录网址 ,带着这些疑问,生物探索有幸采访到这篇文章的最后通讯作者、美国天普大学医学院的华人科学家——胡文辉教授。他表示:“这种‘导弹式靶向剔除潜伏病毒’的尝试给以战胜艾滋病为终点的科学研究带来新的方向,它有望为彻底治愈艾滋病带来希望。”

该研究阐释了乙肝病毒对人类基因的嵌入机制,可望对乙肝引发肝癌的新治疗药物、预防方法以及以线粒体为靶点的新型病毒治疗药物的开发作出贡献。

Anderson说:“新研究结果令我们感到非常兴奋,因为它让我们觉得这是一个可用来治疗一系列疾病——不仅是酪氨酸血症,还有其他疾病的基因修复系统。”

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研究成果近期刊登在《肿瘤靶点》(Oncotarget)杂志网络版。

在这项新研究中,薛文、Anderson和同事们开发出了一种组合的纳米颗粒及病毒传递系统来传送CRISPR修复机器。首先,他们构建出了由脂质和编码Cas9酶的信使RNA构成的一种纳米颗粒。其他两个元件:RNA导向链和校正基因DNA被嵌入到基于腺相关病毒的重编程病毒颗粒中。

实现“永久性治愈”?根源在于潜伏的HIV

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研究人员在使用脂质纳米颗粒的前一周首先给肝细胞注入了病毒,使得这些细胞有时间开始生成RNA向导链和DNA模板。当注入携带Cas9mRNA链的纳米颗粒时,这些细胞开始生成Cas9蛋白质,不过这只能持续数天因为mRNA最终会降解。这一时间长度足以完成基因修复,也防止了cas9继续逗留于细胞中,潜在地破坏细胞基因组的其他部分。

“清除潜伏的HIV”——这是胡文辉教授自2008年在天普大学成立独立实验室以来一直试图克服的难关。他表示:“艾滋病难以治愈的根源正是潜伏于人体内细胞中的艾滋病病毒。”

Anderson说:“一些人担心,如果让Cas9在细胞中存留太长的时间,有可能会导致一些基因组不稳定。我们认为使用mRNA纳米颗粒通过确保Cas9酶不会存在太长的时间,而提高了安全系数。”

根据世界卫生组织的统计数据,全球约有6000万人感染艾滋病毒,其中2000万人已死亡。近4000万感染者,75%集中在15个国家,而中国位列其中。人类免疫缺陷病毒入侵人体,主要通过攻击T淋巴细胞瓦解免疫系统,致使患者免疫功能减弱,增加感染各种疾病或者发生恶性肿瘤的概率,进而威胁生命。

利用这种新方法,每16个细胞中约有1个获得基因纠正,相比于2014年的研究提高了15倍的效率。研究人员还发现相比于将Cas9基因整合到细胞基因组中去的一些方法,新方法造成的脱靶DNA切割较少。

庆幸的是,随着核苷类逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、抗逆转录病毒药物的相继问世,艾滋病不再是无药可治的绝症。“但是,转变成慢性病的艾滋病依然面临多种问题,包括药物副作用、神经损害、心血管损伤等等。”胡文辉教授强调,“在鸡尾酒疗法时代,仍有一半以上的艾滋病患者伴随有不同程度的神经认知功能障碍,而且轻型神经艾滋病患者数量正逐年增加。 ”

论文的主要作者、Koch综合癌症研究所HaoYin说:“我们进行了全基因组分析,证实我们获得了极高水平的打靶效应,而几乎没有脱靶效应。”

HIV作为逆转录病毒,变异性特别强。同时,它们通过将遗传物质永久性插入宿主细胞DNA中,形成病毒库。一般情况下,这些潜伏的病毒处于休眠状态,一旦脱离药物抑制,它们便会重新猖獗。所以,治愈艾滋病必须跨过“潜伏病毒”这一难关。

Anderson实验室已构建出了一些相似的纳米颗粒,现正在临床开发中。由于AAV病毒颗粒现已在一些临床试验中用于其他用途,研究人员乐观地认为这一CRISPR传递方法可以用于人类,不过还需要开展更多的研究来证实这一点。

近年来,科学家们提出了多种针对潜伏病毒的方法,包括“先激活后绝杀”、敲除病毒、永久性潜伏等等,他们希望通过实现从有效治疗到彻底治愈的转变,真正造福于患者。现在,胡文辉教授与同校同事Kamel Khalili教授、美国匹兹堡大学杨文彬教授课题组合作,第一次在动物模型上成功证实,利用基因编辑技术多靶点、高效剔除潜伏病毒的可行性。

研究人员已为这一技术申请了专利,他们认为可以利用它来治疗各种疾病,尤其是肝脏疾病。“在一些代谢疾病和其他的肝病中如果你能够修复突变基因,你就真的能够影响这些患者的健康,”Anderson说。

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论文的作者之一、Koch研究所教授RobertLanger说:“看到我们的研究团队开发出这一新的CRISPR传递方法真是令人感到兴奋,我相信其有潜力造成深远的影响。”

多篇文章,揭示“导弹式靶向剔除潜伏病毒”之旅

CRISPR介导的遗传修复为人类基因治疗提供了一条新思路,当前世界各地的研究小组都在竭力地探索及开发CRISPR的临床治疗潜力。

当被问及“利用基因编辑治疗艾滋病”这一研究思路的由来,胡文辉教授表示:“利用基因编辑技术敲除HIV是解决潜伏病毒的一个重要思路。在我们试图应用传统基因打靶技术、ZFN和TALEN基因编辑技术尚未成功之际,张峰团队开发出可编辑人类基因组的CRISPR/Cas9系统,这给我们提供了一个很好的技术选择。”借助于引导RNA和Cas9核酸酶的完美配合,这一“魔剪”技术能够精准实现目标基因位点的切割、编辑工作。

在2015年12月31日的《科学》上,三个独立研究小组提供了初步的研究证据表明,通过编辑一个与肌肉功能相关的基因,修复杜氏肌营养不良症小鼠的一些肌肉功能,可以治愈这一遗传性疾病。这标志着第一次在完全发育的活体哺乳动物中CRISPR采用一种有潜力转化为人类疗法的策略,成功治疗了一种遗传疾病(延伸阅读:三篇Science文章:利用CRISPR治疗遗传疾病)。

2014年,胡文辉教授课题组和Kamel Khalili教授课题组合作,以实验室培养的潜伏有HIV病毒的人类细胞系为材料,首次成功利用CRISPR实现潜伏病毒的永久性清除,验证了最初的构想。这一利用基因编辑技术将艾滋病病毒从人类基因组中剔除的文章在《PNAS》期刊一经发表,就引起了业界的广泛关注。

此外,来自北京大学的研究人员近期报道称,他们用双gRNAs导向CRISPR/Cas9系统抑制了乙型肝炎病毒复制。研究结果表明,CRISPR/Cas9系统可以有效破坏HBV表达模板,且没有明显的细胞毒性。它有可能是在慢性HBV感染患者中根除持续存在的HBVcccDNA的一种潜在的方法(延伸阅读:北大鲁凤民教授:用CRISPR/Cas9治疗乙肝)。

随后2年多,他们从体外试验转向动物试验,不断优化这一有望彻底治愈艾滋病的治疗方案,并先后在《Scientific Report》、《AIDS》、《Gene Therapy》期刊发表研究成果。

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这一篇最新发表在《Molecular Therapy》期刊的文章再一次揭示了有关靶向根治艾滋病的动物试验的可行性和有效性。

首先,胡文辉教授带领文章一作、博士后尹超然等课题组成员筛选和优化了多个靶向剪接的腺相关病毒的基因疗法,在人类HIV转基因小鼠成功获得高效率剔除已经整合的HIV基因组,且能够显着抑制多个器官组织中HIV的基因表达。随后,胡文辉教授课题组与杨文彬教授课题组合作,使用改建的鼠类HIV病毒建立艾滋病小鼠急性感染模型。因为人类HIV不能感染鼠类动物,他们将带有生物发光报告基因的EcoHIV病毒感染免疫缺陷裸鼠,同时给予HIV多靶点/saCas9的AAV-DJ8(人工合成的AAV血清型,综合了8种自然AAV的血清型特性),然后用活体动物生物发光图像检测仪监测动物全身的EcoHIV动态变化。他们首次证明多靶点基因编辑的AAV-DJ8基因疗法能够高效剔除鼠类HIV病毒,并显着减轻HIV急性感染。最后,他们在人源化小鼠HIV模型上证明多靶点/saCas9的 AAV-DJ8基因疗法能有效剔除多个器官组织中的人类HIV潜伏感染病毒。他们用人类HIV活病毒感染人源化BLT小鼠 (移植有人骨髓、肝和胸腺组织或细胞的免疫缺陷小鼠,其被艾滋病病毒感染和潜伏的方式与人类一致)建立HIV潜伏感染模型,给予HIV多靶点/saCas9的AAV-DJ8,2-4周后在多个器官组织中检测到HIV基因组的成功切除。

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图示:腺相关病毒基因疗法将多靶点基因编辑“魔剪”导入HIV感染小鼠体内准确剔除HIV病毒基因组,进而抑制病毒转录和消除病毒复制。

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“巧妙应对”HIV变异、脱靶、副作用等问题

为什么设计多个靶点?胡文辉教授表示有两个原因:第一,在HIV转录区和结构区设计了2-4个sgRNA实现多靶点切除,这有利于显着增加其剔除效率。第二,艾滋病病毒基因易于突变,应用单靶点基因编辑有可能会出现病毒逃逸现象。他认为:“多个有效靶点同时突变的可能性极小,即便某些个体患者出现突变,我们也可以快速重新设计和构建相关的Cas9基因编辑系统。这正是Cas9基因编辑用于精准医学的优势所在。”

针对CRISPR系统的脱靶问题,胡文辉教授告诉生物探索,他们早期发表的全基因组测序研究结果以及其它实验室的研究结果并没有发现脱靶效应。即使万一单个靶点存在脱靶的可能,但是两个或者多个脱靶点落在同一个正常功能性基因的可能性微乎其微。

胡文辉教授强调,相比于目前的抗逆转录病毒药物,这一基于多靶点基因编辑的基因疗法最大的优势之一在于安全。团队精心筛选的靶点sgRNA都是针对外源性病毒基因的,它们对宿主靶细胞的基因组具有高度特异性,从而确保了在剔除病毒过程中不干扰宿主细胞的存活和功能。他觉得,这种“只杀病毒不杀细胞”的效果至关重要。

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未来,还有哪些挑战?

胡文辉教授表示:“目前,基因编辑疗法尚不能100%清除动物体内的艾滋病病毒,但能够显着降低潜伏病毒量。”谈及这一研究成果距离临床试验的时间,胡文辉教授坦言,尽管目前最看好的AAV基因疗法已经在世界各地进行临床试用,但用于艾滋病病人还有很多挑战和未知需要面对和解决:

第一,艾滋病治疗效果的评估。目前,科学家们只是在活体动物身上取得针对艾滋病的腺相关病毒基因疗法的高效病毒剔除结果,相关的治疗效果评估研究仍在进行之中,尤其是更接近于HIV病人的灵长类动物艾滋病模型,靶向剔除艾滋病病毒的可行性和有效性亟待测试。

第二,基因转移效率难题。在多细胞、组织和器官水平,治疗艾滋病和其它感染性疾病以及遗传性疾病和癌症的确切效果都取决于基因转移效率。

第三,潜伏的宿主细胞。目前,国际公认的HIV潜伏细胞包括T细胞、单核/巨噬细胞。而我们已有的腺相关病毒血清型是否足够转导所有的潜伏T细胞?另外,包括神经干细胞在内的其他细胞是否是尚未被发现的潜伏宿主细胞?

第四,CRISPR/Cas9技术自身的不断完善。Cas核酸酶的不断小型化和多元化?基因编辑的效率优化和特异性优化?

未来,能否找到靶向所有免疫细胞或者HIV潜伏细胞特异的基因疗法?是否可以借助纳米科技、类病毒颗粒优化CRISPR系统?采访最后,胡文辉教授畅谈了很多新想法。他说:“对于基因治疗艾滋病等疑难杂症的应用前景,我很有信心,也充满期待。下一步,我们将继续探索更有效、安全的基因疗法和细胞疗法。”

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关于胡文辉教授

胡文辉博士毕业于中国协和医科大学基础医学研究所,是天普大学医学院代谢疾病研究中心和病理学系的终身副教授,同时也是四川大学华西医院的客座教授。他的研究工作获得多项美国国家卫生院基金资助,其研究方向集中在艾滋病治愈、神经发育障碍、肥胖和胃肠道神经肌肉调节,先后发表学术文章70余篇,并拥有4项专利。

编辑:科学研究 本文来源:薛文博士Nature子刊,专访胡文辉教授

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